白芍总苷（ total glucosides of peony ， TGP ）为白芍的有用部位，首要含芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、羟基芍药苷等单萜糖苷类化合物，为白芍的药效物质根底 [1-3] 。现代药理学研讨证明， TGP 具有抗炎、抗氧化、调理免疫、保肝等多种药理活性 [4] ，其间成药制剂 TGP 胶囊（商品名帕夫林）在临床上已广泛用于类风湿性关节炎等的辅佐医治，效果切当 [5] 。可是现在对 TGP 多成分、多靶点、整合效果的机制及体内进程研讨还较单薄。

　　中药多成分药动学研讨首要提醒中药多种有用成分的体内进程，对协助阐释中药整合调理效果机制及辅导临床合理用药等都具有重要效果。现在，以含量较高的活性成分芍药苷、芍药内酯苷为药动学标志物的 TGP 体内药动学进程已有较多研讨 [6-8] ，但对部分含量较低的单萜糖苷类活性成分如苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷等的体内药动学特征还少见报导。机体疾病情况或许影响药物在体内的吸收、散布、代谢和分泌等药动学进程，阐明药物在正常生理和病理情况下的药动学差异，关于协助临床合理制定给药计划具有重要含义。对各种类型肝损害的维护效果是 TGP 的首要临床效果之一 [9-11] ，因而讨论肝损害对 TGP 多种活性成分药动学特征的影响，能够协助较全面提醒 TGP 保肝效果的药理机制及体内进程。本研讨前期发现， TGP 入血成分除了首要的芍药苷和芍药内酯苷外，还可监测到少数的没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷，且其药时改变进程具有规律性。因而，本研讨以 TGP 中 4 个活性成分芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷为药动学标志物，依据 LC-MS 技能比照剖析 TGP 在正常和四氯化碳（ carbon tetrachloride ， CCl4 ） 诱导急性肝损害大鼠体内的药动学差异，以期协助全面阐明 TGP 多成分的体内进程特征，为 TGP 保肝效果的机制研讨及临床用药的合理辅导供给参阅依据。

　　SPF 级雄性 SD 大鼠，体质量 260 ～ 280 g ，由浙江维通利华试验动物技能有限公司供给，动物许可证号 SCXK （浙） 2019-0001 。大鼠养殖于嘉兴学院试验动物中心，养殖环境 12 h 光照漆黑循环，正常饮食饮水，适应性养殖 7 d ，试验前禁食 12 h 。动物试验经嘉兴学院试验动物道德委员会审阅（同意号 JUMC2022-055 ），试验进程契合各项道德要求。

　　对照品芍药苷（批号 M28GB143089 ）、芍药内酯苷（批号 O31GB166251 ）、没食子酰芍药苷（批号 M20H182502 ）购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均≥ 98% ；对照品苯甲酰芍药苷（批号 170526 ，质量分数＞ 98% ）、龙胆苦苷（批号 200908 ，质量分数＞ 98% ）购自上海融禾医药科技有限公司； TGP 胶囊（批号 210813 ）由宁波立华制药有限公司出产，经含量测定别离含芍药苷 360.2 mg/g 、芍药内酯苷 108.6 mg/g 、没食子酰芍药苷 7.9 mg/g 和苯甲酰芍药苷 6.0 mg/g ；质谱级乙腈、甲醇均购自上海泰坦科技股份有限公司；质谱级甲酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司；色谱级醋酸乙酯购自杭州青辰化学试剂厂；色谱级 CCl4 购自江苏强盛功用化学股份有限公司；注射用生理盐水购自杭州民生药业股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ alanine aminotransferase ， ALT ）试剂盒（批号 20210819 ）、天冬氨酸氨基转移酶（ aspartate aminotransferase ， AST ）试剂盒（批号 20210818 ）、总胆汁酸（ total bile acid ， TBA ）试剂盒（批号 20210819 ）均购自南京建成生物工程研讨所；超纯水为 Milli-Q 超纯化体系克己。

　　2.1.2 肝损害大鼠模型树立、给药与样品收集 随机取正常 SD 大鼠 8 只，选用一次性 ip 40% CCl4 溶液（ 2 mL/kg ）诱导树立急性肝损害模型。造模 24 h 后，检测正常组和模型组血清肝功用目标（ ALT 、 AST 、 TBA ），成果见图 1 ，经双侧 t 查验剖析模型组大鼠血清中各项 目标均较正常组显着升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），标明造模成功。各模型组大鼠同正常组给药量 ig TGP 生理盐水溶液后，按 “ 2.1.1 ” 项下办法收集血清样品。

　　2.2.1 对照品及内标储藏液的制备 各精细称取对照品芍药内酯苷 3.6 mg 、芍药苷 5.2 mg 、没食子酰芍药苷 5.0 mg 、苯甲酰芍药苷 0.8 mg 和内标龙胆苦苷 2.5 mg ，别离选用甲醇溶解，并定容至 1 mL ，得质量浓度别离为 3.6 、 5.2 、 5.0 、 0.8 、 2.5 mg/mL 的对照品及内标储藏液， 4 ℃保存备用。

　　2.2.2 高、中、低质量浓度质控样品的制备 精细量取各对照品储藏液适量混合，用甲醇定容制造成高、中、低 3 种质量浓度的质控规范溶液，其间芍药内酯苷质量浓度别离为 500 、 125 、 25 ng/mL ，芍药苷质量浓度别离为 2000 、 500 、 100 ng/mL ，没食子酰芍药苷质量浓度别离为 10 、 2.5 、 0.5 ng/mL ，苯甲酰芍药苷质量浓度别离为 5 、 1.25 、 0.25 ng/mL ，规范溶液于 4 ℃保存。使用时，别离精细量取各质量浓度质控规范溶液 250 μL 于 2 mL 聚丙烯管中， 45 ℃离心浓缩蒸干溶剂后，残渣参加空白大鼠血清 250 μL ，涡旋振动 5 min 溶解后作为质控样品。

　　2.5.1 专特点 别离取大鼠空白血清、参加混合对照品溶液的空白血清和大鼠 ig TGP 后的血清样品，依照“ 2.3 ”项下的血清样品办法处理后，按“ 2.4 ”项下测定条件进样剖析，记载色谱图，见图 2 。各成别离离度杰出，芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷和内标龙胆苦苷的保存时间别离为 9.09 、 9.41 、 10.14 、 12.71 、 8.79 min ，血清内源性物质对待测成分及内标均无搅扰。

　　2.5.2 定量限和线性 规模 精细汲取各对照品溶液适量，混匀后选用甲醇定容得必定质量浓度的混合对照品溶液，再用甲醇逐级稀释成一系列不同质量浓度的混合对照品溶液。别离取不同质量浓度的各混合对照品溶液各 250 μL ，于 45 ℃离心浓缩蒸干溶剂，再别离参加 250 μL 空白血清涡旋振动 5 min 混匀，得到一系列不同质量浓度的血清规范溶液，按“ 2.3 ”项下的血清样品办法处理后，按“ 2.4 ”项下办法测定。以各待测物信噪比为 10 确认各成分的定量下限。选用内标法，以血清中各待测物的浓度为横坐标（ x ），各待测物与内标的峰面积比值为纵坐标（ y ），求算各待测物的线性回归方程和相联系数。各待测物的回归方程、线性规模、相联系数（ R 2 ）及定量限见表 1 。

　　2.5.3 准确度和精细度 取高、中、低 3 个质量浓度的质控样品各 6 份，按“ 2.3 ”项下办法处理后，按“ 2.4 ”项下办法进样剖析，核算各待测物高、中、低质量浓度血清规范样品的日内准确度和精细度。别离在 6 d 中制造 6 份高、中、低 3 个质量浓度的血清质控样品，按“ 2.3 ”项下办法处理后，按“ 2.4 ” 项下办法进样剖析，核算各待测物高、中、低质量浓度血清规范样品的日间准确度和精细度。成果见表 2 ，办法的准确度和精细度杰出。

　　2.5.4 提取回收率和基质效应 取高、中、低 3 个质量浓度的质控样品各 6 份，按“ 2.3 ”项下办法处理后，按“ 2.4 ”项下办法进样剖析，记载各成分峰面积为 A ；另取 250 µL 大鼠空白血清，按“ 2.3 ”项下办法处理后，残渣别离参加 250 μL 高、中、低质量浓度的质控混合对照品溶液，涡旋震动混匀 5 min ，于 45 ℃离心浓缩蒸干溶剂，残渣再参加 50 μL 80% 甲醇，涡旋震动 5 min 溶解， 14 000 r/min 离心 5 min ，取上清液进样剖析，记载各成分峰面积为 B ，核算提取回收率（ A/B ）；另取 250 μL 高、中、低质量浓度的质控混合对照品溶液各 6 份，按“ 2.3 ”项下办法处理后，残渣别离参加 50 μL 80% 甲醇，涡旋震动 5 min 溶解， 14 000 r/min 离心 5 min ，取上清液进样剖析，记载各成分峰面积记为 C ，核算基质效应（ B/C ）。成果见表 3 ，办法的提取回收率和基质效应契合生物样本剖析的要求。

　　2.5.5 稳定性 取高、中、低 3 个质量浓度的质控样品，别离调查 3 种情况下的稳定性。 ① 短期稳定性：将质控样品处理后，在室温下放置于进样盘上 24 h 后进样剖析； ② 冻融稳定性：将质控样品在 − 20 ℃冰箱中重复冻融 3 次后再处理剖析； ③ 长时间稳定性：将质控样品在 − 20 ℃冰箱冻存 7 d 后再处理剖析。每种稳定性调查情况下，每个质量浓度各平行 6 份。成果见表 4 ， 3 种情况下样品稳定性杰出，契合生物样本剖析的要求。

　　大鼠 ig TGP 后，依照上述所树立的办法测定各时间点血药浓度，制作均匀血药浓度 - 时间曲线 。选用 WinNonlin 5.3 药动学软件以非房室模型剖析核算正常组和模型组各成分的药动学参数，首要包含消除半衰期（ t 1/2 ）、均匀停留时间（ MRT0 ～∞ ）、血药浓度 - 时间曲线下面积（ AUC ）、达峰浓度（ C max ）、达峰时间（ T max ）、表观散布容积（ Vd/F ）和消除率（ CL/F ）。选用双侧 t 查验对正常组和模型组各个药动学参数进行显着性差异剖析。成果见表 5 ，与正常组比较，芍药苷、芍药内酯苷在肝损害大鼠体内的 t 1/2 和 MRT0 ～∞ 均显着延伸（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， AUC 显着添加（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）， CL/F 显着下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；苯甲酰芍药苷在肝损害大鼠体内的 t 1/2 和 MRT0 ～∞ 无显着改变， AUC 显着添加（ P ＜ 0.01 ）， Vd/F 和 CL/F 显着下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；没食子酰芍药苷在正常组和模型组大鼠体内的药动学参数均无显着性差异。阐明 CCl4 诱导的急性肝损害疾病情况对 TGP 不同活性成分体内药动学进程的影响存在差异。

　　芍药苷和芍药内酯苷为 TGP 的首要药效成分，其含量高、活性清晰，因而大都有关 TGP 的效果机制、体内进程及临床效果点评均以这 2 个成分为代表打开，较少重视其他单萜糖苷类成分。本课题组在前期对 TGP 物质组成的研讨中发现，除了芍药苷、芍药内酯苷外， TGP 中还含有少数的没食子酰芍药苷、苯甲酰芍药苷和羟基芍药苷，进一步的入血成分研讨发现没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷均可少数入血且存在规律性的药 - 时改变联系。没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷均为芍药苷的活性衍生物，近年来较多研讨证明其具有抗炎、抗氧化和免疫调剂等药理活性，对胃炎、骨质疏松症、非小细胞肺癌和败血症等具有潜在的医治成效 [12-16] 。因而，有必要一起讨论 TGP 多种活性成分的体内进程，为其多成分协同效果机制研讨供给依据。本研讨发现，在 TGP 的临床给药剂量下，可检测到的首要入血成分仍为芍药苷和芍药内酯苷，没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷的给药量约为芍药苷的 1/50 ～ 1/100 ，可是其达峰浓度仅约为芍药苷的 1/1000 ，剖析原因或许是这 2 个成分入血后大部分被敏捷代谢为中心产品芍药苷 [17-18] ，仅剩少数的入血原型药物，因而提示在对 TGP 多成分和谐效果的药效点评时，应充分考虑各成重量的差异。

　　研讨发现在 TGP 临床给药剂量下，芍药苷和芍药内酯苷在正常大鼠体内的 t 1/2 和 MRT 别离为 2 ～ 3 h 和 3 ～ 4 h ，与大都已有研讨相符 [6] 。 CCl4 诱导急性肝损害可显着延伸芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的 t 1/2 和 MRT ，并显着添加 AUC ，下降 CL/F ，阐明肝损害疾病情况使 TGP 首要成分代谢减慢、体内停留时间和露出程度添加。刘恩荔等 [19] 也调查了 CCl4 诱导急性肝损害对芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内药动学的影响，相同发现急性肝损害使这 2 个成分的 C max 、 AUC0 ～t 显着增大， t 1/2 延伸； Jiang 等 [20] 比较了正常和急性胆汁淤积型肝炎大鼠 ig 赤芍提取物后，芍药苷和芍药内酯苷在 2 组大鼠体内的药动学差异，成果也显现急性肝损害可显着添加 2 个成分的 T max 和 AUC0 ～t 。归纳文献报导及本研讨成果阐明急性肝损害在某种程度上或许增强 TGP 的保肝药效，也提示临床上应留意依据实际情况调整给药计划。肝脏是药物在体内生物转化和代谢的最重要器官，肝损害或许经过影响肝微粒体 CYP450 酶的活性然后影响药物体内代谢 [21] ，研讨发现 CCl4 对 5 种 P450 酶（ CYP1A2 、 CYP2C9 、 CYP2C19 、 CYP2D6 和 CYP3A4 ）均有显着的按捺效果 [22] ；此外，肝损害或许引起胃肠道菌群紊乱、按捺药物肠道转运然后影响体内代谢 [23-24] ，因而， CCl4 诱导急性肝损害终究经过哪些环节影响 TGP 体内进程还需要深化探求。本研讨发现没食子酰芍药苷在正常组和模型组大鼠体内的药动学参数差异无统计学含义，或许与大鼠组内个体差异大、血药浓度偏低一级有关，别的，肝损害使没食子酰芍药苷在大鼠体内的药 - 时曲线出现较显着的双峰现象，阐明肝损害对其体内进程的影响较为杂乱，或许触及肠肝循环、肾小管重吸收等进程。研讨成果苯甲酰芍药苷在正常和肝损害大鼠体内的 t 1/2 和 MRT0 ～∞ 无显着差异，但肝损害使 AUC 显着添加、 Vd/F 和 CL/F 显着下降，剖析原因或许肝损害部分按捺了苯甲酰芍药苷向芍药苷的代谢转化，使其原型成分的体内露出量添加，但详细原因还需要进一步深化研讨。 本研讨初次对 TGP 中 4 个活性单萜糖苷类成分芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷和苯甲酰芍药苷一起展开了药动学研讨，并比照剖析了 4 个成分在正常和 CCl4 诱导急性肝损害大鼠体内的药动学差异，可为进一步探求 TGP 多成分协同的保肝效果机制供给试验根底，一起为该中药的临床合理用药供给辅导参阅。

　　来 源：陶西雨，程晓羽，魏真真，周菁杨，敖 雷，，韩 丰，郑永霞，詹淑玉．白芍总苷中4个活性成分在正常和四氯化碳诱导的急性肝损害大鼠体内药动学比较研讨 [J]. 中草药, 2023, 54(13):4224-4232.

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